Larry Daley, o ex-guarda noturno do Museu de História Natural, agora é um sucesso empresarial. Mas, logo depois de ficar sabendo que seus amigos do museu foram enviados para o Museu Smithsonian, Larry recebe um telefonema desesperado de Jedediah, avisando que quatro dos maiores vilões da história voltaram à vida e planejam tomar o Smithsonian, e depois o mundo. Larry se junta a velhos e novos amigos para deter os planos diabólicos.

Tugg Speedman (Ben Stiller), Kirk Lazarus (Robert Downey Jr.) e Jeff Portnoy (Jack Black) são grandes astros de Hollywood, que acertaram suas presenças em "Trovão Tropical", novo filme do diretor inglês Damien Cockburn (Steve Coogan). O projeto é a adaptação da biografia de "4 Folhas" Tayback (Nick Nolte), um veterano da Guerra do Vietnã. A equipe vai ao próprio Vietnã para realizar as filmagens, mas logo o ego dos atores principais causa problemas. Tentando controlar o trio, Damien decide rodar as cenas em plena floresta, sem imaginar os perigos que sua decisão traria.

Quando Larry Daley é contratado como guarda noturno no museu, ele logo descobre que todos os seres do museu ganham vida após o pôr-do-sol. Logo de cara, Larry se vê frente a frente com um brincalhão esqueleto de T. Rex, mas também é cercado por exércitos de minúsculos soldados romanos e por caubóis armados. Para completar, há um macaquinho endiabrado que o deixa maluco! Mas talvez ele consiga descobrir um modo de controlar o caos e tornar-se um herói aos olhos de seu filho.